Pomen predobdelave vzorca
Predobdelava vzorca je zamuden korak pri instrumentalni analizi (zlasti pri kromatografski analizi), ki zahteva napake. Kakovost obdelave vzorca neposredno vpliva na končni rezultat kromatografske analize. Zato je za izboljšanje učinkovitosti analize in določanja pomembno izboljšanje in optimizacija metod in tehnik za pripravo vzorcev za kromatografsko analizo. Ker nekateri vzorci pripadajo kompleksnim matričnim sistemom, ki vsebujejo komponente, kot so beljakovine, olja, ogljikovi hidrati, pigmenti itd., bo kompleksno matrično ozadje povzročilo velike težave pri ekstrakciji, ločevanju, čiščenju in določanju ciljnih spojin, ki jih je treba analizirati. Zato predobdelava vzorca ni samo zapletena in težka, ampak ima tudi odločilno vlogo pri točnosti, zanesljivosti in občutljivosti rezultatov analize.
Odstotek porabe časa za predobdelavo vzorca
Za visoko občutljive instrumente LC/MS/MS je pravilna predobdelava vzorca ključnega pomena za zmanjšanje interference matriksa in obogatitev komponent.
Načela predobdelave vzorcev
Izogibajte se kemičnim spremembam komponent med pripravo; preprečevanje in izogibanje kontaminaciji vnaprej določenih komponent; zmanjšajte vnos nepomembnih spojin v postopek priprave; in naj bo čim bolj preprosto in enostavno.
Namen predobdelave vzorca
Odstranite delce; zmanjšanje motečih nečistoč; koncentrat komponent v sledovih; izboljšati občutljivost in selektivnost zaznavanja; izboljša učinek ločevanja; zaščititi kromatografske kolone in instrumente; zamenjava topila.
Trend razvoja predobdelave vzorcev
▶Običajna predobdelava vzorca vključuje: Metodo razkroja: metodo postavitve vzorca s kislino, oksidantom, katalizatorjem itd. v refluksno napravo ali zaprto napravo, segrevanje in razgradnjo ter uničenje organske snovi. Metoda mokre prebave
1. Metoda razgradnje z dušikovo kislino (za bolj bistre vzorce vodne raztopine) 2. Metoda razgradnje z dušikovo kislino in perklorovo kislino (razgradnja vzorcev, ki vsebujejo organske snovi, ki se težko oksidirajo) 3. Metoda razgradnje z dušikovo kislino in žveplovo kislino (dušikova kislina: žveplova kislina=5:2, pogosto z dodajanjem majhne količine vodikovega peroksida) 4. Metoda razgradnje žveplove kisline in fosforne kisline (pomaga za odpravo motenj Fe3+ ionov med določanjem) 5. Metoda razgradnje z žveplovo kislino in kalijevim permanganatom (običajno uporabljena za določanje vzorcev vodne raztopine živega srebra) 6. Metoda razgradnje z dušikovo kislino in vodikovim peroksidom: nekateri uporabljajo to metodo za prebavo bioloških produktov za določanje dušika, fosforja, kalija, bora, arzena, fluora in drugih elementov 7. Metoda večkomponentne razgradnje: Potreben je sistem za razgradnjo s tremi ali več kislinami ali oksidanti. Metoda suhega pepela (metoda razgradnje pri visoki temperaturi)
1. Metoda s pepelom ne uporablja ali uporablja majhno količino kemičnih reagentov za razgradnjo vzorcev in lahko obravnava večje vzorce tehtanja, zato je koristno izboljšati natančnost določanja elementov v sledovih. 2. Temperatura upepelitve je na splošno 450-550 stopinj, kar ni primerno za obdelavo vzorcev s hlapnimi komponentami, čas upepelenja pa je tudi relativno dolg. 3. Glede na vrsto vzorca in lastnosti komponent, ki jih je treba meriti, so izbrani različni lončki in temperature upepelitve. Pogosto uporabljeni lončki so iz kremena, platine, srebra, niklja, železa, porcelana, politetrafluoroetilena in drugih lastnosti. Načelo je, da lonček ne reagira z vzorcem in je stabilen pri temperaturi obdelave. 4. Običajno se upepeljenim biološkim vzorcem ne dodajo nobeni drugi reagenti, vendar se za spodbujanje razgradnje in zaviranje izgube določenih elementov zaradi izhlapevanja pogosto doda ustrezna količina pomožnega upepelilnega sredstva. Ko je vzorec popolnoma upepelen, se za analizo in določanje raztopi v razredčeni dušikovi kislini ali klorovodikovi kislini.
Conventional pretreatment methods Extraction and enrichment 1. Extraction method 1. Oscillation extraction method (vegetables, fruits, grains) 2. Tissue crushing extraction (extracting organic pollutants from animal and plant tissues) 3. Soxhlet extraction (commonly used to extract organic pollutants such as pesticides, petroleum, phenylhydrazine and pyrene from biological and soil samples) 2. Volatilization and evaporation concentration The volatile separation method uses the high volatility of certain components or converts the components to be measured into volatile substances, and then uses inert gas to take them out to achieve the purpose of separation. Evaporation concentration refers to heating the water sample on a hot plate or in a water bath to slowly evaporate the water, so as to reduce the volume of the water sample and concentrate the components to be measured. 3. Distillation method uses the different boiling points of the components of the water sample to separate them from each other; when determining volatile phenols, cyanides, and fluorides in water samples, they must first be pre-distilled and separated in an acidic medium; distillation has three functions: digestion, enrichment, and separation. 4. Ion exchange method uses ion exchangers to exchange reactions with ions in the solution for separation. Ion exchangers can be divided into inorganic ion exchangers and organic ion exchangers (ion exchange resins). ㈤ Coprecipitation method: The phenomenon that a poorly soluble compound in a solution carries out certain coexisting trace components in the process of forming a precipitate. The principle of coprecipitation is based on surface adsorption, the formation of mixed crystals, the interaction and inclusion of heteroelectron nuclei colloidal substances, etc. 1. Coprecipitation separation using adsorption: Common carriers include Fe (OH) 3, Al (OH) 3, Mn (OH) 2 and sulfides, etc. 2. Coprecipitation separation using the formation of mixed crystals 3. Coprecipitation separation using organic coprecipitants ㈥ Adsorption method: Use porous solid adsorbents to adsorb one or several components in the water sample on the surface to achieve the purpose of separation. Commonly used adsorbents include activated carbon, alumina, molecular sieves, large mesh resins, etc. The polluted components adsorbed and enriched on the surface of the adsorbent can be desorbed by organic solvents or heated for determination. ㈦ Chromatography Chromatography is divided into column chromatography, thin layer chromatography, paper chromatography, etc., and adsorbents are divided into inorganic adsorbents and organic adsorbents. ㈧ Sulfonation and saponification Sulfonation: The interfering substances such as fats and waxes in the extract can undergo sulfonation reaction with concentrated sulfuric acid to generate highly polar sulfonic acid compounds, which are separated from the pesticides in the extract as the sulfuric acid layer separates. The sulfonation method uses the saponification reaction of oils and fats with strong alkali to generate fatty acid salts and separate them. ㈨ Low-temperature freezing method is based on the principle that the solubility of different substances in the same solvent varies with temperature to separate them from each other. ㈩ Principle of extraction: The distribution coefficient of substances in different solvent phases is different, so as to achieve the separation and enrichment of components. Types of conventional liquid-liquid extraction Extraction of organic substances: Organic substances separated in the aqueous phase are easily extracted by organic solvents Extraction of inorganic substances: First, a reagent is added to combine with the ionic components in the aqueous phase to generate a substance that is uncharged and easily soluble in organic solvents. The reagent, organic phase, and aqueous phase together form an extraction system. According to the different types of extractables generated, it can be divided into chelate extraction system, ion-association complex extraction system, ternary complex extraction system, and synergistic extraction system. Overview of solid phase extraction (SPE) It is developed by combining liquid-solid extraction and column liquid chromatography technology. SPE is a column chromatography separation process, which has many similarities with high performance liquid chromatography (HLPC) in terms of separation mechanism, stationary phase and solvent selection. The particle size of SPE filler (>40 μm) je večji od HLPC (3-10 μm). Zato se lahko SPE uporablja samo za ločevanje spojin z zelo različnimi retenzijskimi lastnostmi. Tehnologija SPE z nizko učinkovitostjo ločevanja se uporablja predvsem za obdelavo vzorcev. Namen SPE je iz vzorca odstraniti snovi, ki motijo poznejšo analizo; obogatiti komponente v sledovih in izboljšati analitično občutljivost; spremenite topilo vzorca, da se ujema z analitično metodo; in situ derivatizacija; razsoljevanje vzorcev; ter olajšati shranjevanje in transport vzorcev. Montažna kolona SPE: Velikost delcev polnila se razlikuje od polnila kolone HLPC, ostalo pa je enako. Najbolj uporabljena je faza C18. Ta vrsta polnila je zelo hidrofobna in kaže zadrževanje večine organskih snovi v vodni fazi; uporabljajo se tudi drugi materiali z drugačno selektivnostjo in zadrževalnimi lastnostmi. SPE faze z aktivnimi skupinami ali prevlečene z aktivnimi spojinami se lahko uporabljajo za analizo reakcij derivatizacije. SPE disk: zelo podoben membranskim filtrom. Ekstraktor diska je disk iz PTFE, ki vsebuje polnilo ali ploščo iz steklenih vlaken, napolnjeno s polnilom; polnilo predstavlja približno 60 % do 90 % celotnega diska SPE, debelina diska pa je približno 1 mm. Razlika od prvega je razmerje debelina postelje/premer (L/d). Primerno za obogatitev sledov onesnaževal iz vode. Mikroekstrakcija v trdni fazi (SPME) Offline in Online SPE Offline SPE 1. SPE in analiza se izvajata neodvisno, SPE pa zagotavlja samo ustrezne vzorce za poznejšo analizo. 2. Da bi zagotovili zadosten stik med raztopino vzorca in polnilom, pretok topila ne sme biti previsok. 3. Lahko se dokonča z avtomatiziranimi instrumenti. Avtomatski instrument SPE je sestavljen iz stojala za kolone, batne črpalke, rezervoarja za tekočino, cevovoda in procesorja vzorcev. Spletna SPE je znana tudi kot spletna tehnologija čiščenja in obogatitve, ki se uporablja predvsem za vzpostavitev metode SPE analize HLPC. Namen predobdelave kolone: 1. Odstranite nečistoče, ki lahko obstajajo v polnilu; 2. Raztopite polnilo in izboljšajte ponovljivost ekstrakcije trdne faze. Dodatek vzorca 1. Da preprečite izgubo analitov, koncentracija topila v vzorcu ne sme biti previsoka; 2. Pri ekstrakciji z reverzno fazno mehaniko se kot topilo uporablja voda ali pufer, količina organskega topila pa ne presega 10 % (V/V); 3. Za premagovanje izgube analitov med dodajanjem vzorca lahko uporabite šibka topila za razredčenje vzorca, zmanjšanje prostornine vzorca, povečanje količine polnila v koloni SPE in izbiro adsorbentov, ki močno zadržijo analit. Elucija in zbiranje analitov (drug primer je, da se nečistoče zadržijo, medtem ko analiti prehajajo skozi kolono) (ekstrakcija v trdni fazi s trdnimi disperzijskimi mediji) 1. Za kolone za ekstrakcijo z reverzno fazo je čistilno topilo voda ali pufer, ki vsebuje ustrezno koncentracijo organskih topilo; 2. Za določitev optimalne koncentracije in volumna čistilnega topila dodajte vzorec v kolono SPE, ga očistite s 5- do 10-kratnim volumnom postelje kolone SPE, po vrsti zberite in analizirajte efluent ter pridobite profil elucije čistilnega topila za analit. Zaporedoma povečajte jakost čistilnega topila in določite ustrezno jakost in prostornino čistilnega topila glede na profil elucije analita pri različnih jakostih; 3. Namen elucije in zbiranja: popolnoma eluirati analit in ga zbrati v najmanjšem volumskem deležu, pri tem pa zadržati čim več nečistoč, ki se močneje zadržujejo kot analit na SPE koloni; 4. Če želite povečati koncentracijo analita ali prilagoditi lastnosti topila za nadaljnjo analizo, lahko zbrano frakcijo analita posušite z dušikom in nato raztopite v majhnem volumnu topila. Uporaba okoljske analize SPE 1. Koncentracija analitov v okoljskih vzorcih, kot je površinska voda, je zelo nizka, zato je treba analit pred analizo obogatiti. 2. Sestava bioloških tekočin je zapletena in vsebuje veliko količino beljakovin. Pred analizo je treba vzorec predhodno obdelati, da odstranimo beljakovine. Analiza zdravil Klinična analiza Analiza hrane in pijače Mikroekstrakcija v trdni fazi (SPME) Mikroekstrakcija v trdni fazi združuje "vzorčenje, ekstrakcijo, koncentracijo in vbrizgavanje" in se lahko uporablja v povezavi s plinsko kromatografijo ali tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti za tehnologijo predobdelave vzorcev. Teorija mikroekstrakcije trdne faze Teorija ravnotežja: Med postopkom adsorpcije se med trdno in tekočo ali plinasto fazo vzpostavi adsorpcijsko ravnovesje. V določenem časovnem obdobju zaradi počasnega procesa prenosa mase ravnovesje ni v celoti doseženo. Selektivnost ekstrakcije premaznega materiala je v glavnem odvisna od učinkovitosti premaznega materiala. V skladu z načelom, da se analit zlahka ekstrahira s trdno fazo s podobno polarnostjo, se izbere ustrezna prevleka SPE. Najpogosteje uporabljeni snovi za premaze na trdni fazi sta polimetilsiloksan (PDMS) in poliakrilat (PA), oba pa se lahko uporabljata za plinsko kromatografijo in tekočinsko kromatografijo. Prvi se večinoma uporablja za nepolarne spojine, kot so hlapne spojine, policiklični aromatski ogljikovodiki in aromatski ogljikovodiki, drugi pa se večinoma uporablja za polarne spojine, kot so triazini in fenolne spojine. Plast trdne faze je lahko prevlečena na kremenčevo vlakno v nevezani, vezani ali delno zamreženi obliki. Dodajanje nekaterih polimerov premazu lahko poveča površino premaza in izboljša učinkovitost SPME. 1. Polidimetilsiloksan-divinilbenzen (PDMS-DVB), ki se uporablja za aromatske ogljikovodike in hlapne spojine. 2. Polietilen glikol-divinilbenzen (CW-DVB), ki se uporablja za polarne spojine, kot so alkoholi. 3. Polietilen glikolna šablonska smola (CW-TPR), ki se uporablja za ionizirane površinsko aktivne snovi. 4. Kremenčeva vlakna, prevlečena z grafitnimi sajami, ki se uporabljajo za analizo sledov onesnaževal v vodi in zraku. 5. Vzpostavitev metod za ogljikove nanocevke in nanocevke iz titanovega dioksida 1. Ohranite doslednost pogojev vzorčenja. 2. Dejavniki, ki vplivajo na vzorčenje, vključujejo čas vzorčenja, temperaturo, globino vlaken itd. 3. Ohranite linearno razmerje med vrednostjo odziva in začetno koncentracijo analita. Koncentracija vzorca ne sme biti previsoka in prostornina vzorca ne sme biti premajhna, tako da je ekstrakcija znotraj linearnega območja adsorpcijske izoterme. 4. Dodajanje elektrolitov vzorcu lahko poveča ionsko moč raztopine, s čimer se zmanjša topnost analita in izboljša učinkovitost ekstrakcije; sprememba pH vzorca ima večji vpliv na stopnjo ekstrakcije kislih in alkalnih snovi. Opomba: učinek dodajanja soli pri mikroekstrakciji je včasih drugačen od učinka običajne ekstrakcije tekočina-tekočina, zato je treba eksperimentalne pogoje optimizirati. 5. Mešanje lahko skrajša čas ekstrakcije. Mikrovalovna ekstrakcija (MAE) Mikrovalovna ekstrakcija ima kratek čas ekstrakcije, dobro selektivnost, visoko stopnjo izkoristka, nizko porabo reagenta, nizko onesnaženje, lahko uporablja vodo kot ekstrakcijo in lahko samodejno nadzoruje pogoje priprave vzorcev; ima manj aplikacij in se trenutno uporablja pri ekstrakciji policikličnih aromatskih ogljikovodikov, ostankov pesticidov, organokovinskih spojin, učinkovin v rastlinah, škodljivih snovi, kovin v mineralih, zdravil v krvi in ostankov pesticidov v bioloških vzorcih. Principi in značilnosti metod mikrovalovne ekstrakcije Absorbira mikrovalove (voda, etanol, kislina, alkalije in soli) Visoka učinkovitost mikrovalovne ekstrakcije: 1. Neposredno delovanje mikrovalov na ločene snovi; 2. Za mikrovalovno ekstrakcijo je ugodneje uporabljati polarna topila kot nepolarna topila; 3. Uporaba zaprtih posod omogoča mikrovalovno ekstrakcijo, ki se izvaja pri temperaturi, ki je veliko višja od vrelišča topila, s čimer se znatno izboljša učinkovitost mikrovalovne ekstrakcije Reflektirajo mikrovalove (kovinske snovi) Predajajo mikrovalove (nepolarne snovi) Mikrovalovna ekstrakcija oprema in metode (glavne komponente so posebej izdelane mikrovalovne grelne naprave, ekstrakcijske posode ter naprave za nadzor tlaka in temperature, opremljene v skladu z različnimi zahtevami) Več votlin 2450MHz: Naenkrat je mogoče pripraviti več vzorcev, enostavno je nadzorovati pogoje ekstrakcije in ekstrakcija je hitra. Običajna metoda mikrovalovne ekstrakcije: z ekstrahiranimi vzorci zmešajte polarna topila ali mešanico polarnih topil in nepolarnih topil, jih dajte v mikrovalovne posode za pripravo vzorcev in segrejte v mikrovalovnem sistemu za pripravo vzorcev v zaprtem stanju. Nadzorujte tlak ali temperaturo in čas ekstrakcije v skladu z zahtevami ekstrahiranih komponent; na koncu segrevanja vzorec filtriramo, filtrat pa neposredno izmerimo ali izmerimo po ustrezni obdelavi. V normalnih okoliščinah je čas segrevanja ekstrakcije v mikrovalovni pečici približno 5 do 10 minut. Skupna prostornina ekstrakcijskega topila in vzorca ne sme presegati 1/3 prostornine skodelice za pripravo vzorca. Enonačinsko fokusiranje 2450MHz: nadzor tlaka in temperature ni potreben, prostornina za pripravo vzorca je velika, naenkrat je mogoče pripraviti samo en vzorec in čas ekstrakcije je dolg. Ekstrakcija superkritične tekočine (SCF)
Superkritična tekočina (SCF) je tekočina, katere temperatura in tlak sta višja od kritične točke. Njegove lastne značilnosti so: 1. njegov difuzijski koeficient je manjši kot pri plinu, vendar za en red velikosti višji kot pri tekočini; 2. Njegova viskoznost je blizu viskoznosti plina; 3. Njegova gostota je podobna gostoti tekočine in majhna sprememba tlaka lahko povzroči znatno spremembo njene gostote; 4. Spremembe tlaka ali temperature lahko povzročijo fazne spremembe. Osnovno načelo V superkritičnem stanju pride superkritična tekočina v stik s snovjo, ki jo je treba ločiti, tako da lahko selektivno ekstrahira komponente polarnosti, vrelišča in relativne molekulske mase, gostota in dielektrična konstanta superkritične tekočine pa se povečata. z naraščanjem tlaka zaprtega sistema se povečuje polarnost. Komponente različnih polaritet je mogoče ekstrahirati korak za korakom z uporabo programskega povečanja. Topnost superkritičnega CO2: 1. Lipofilne komponente in komponente z nizkim vreliščem je mogoče ekstrahirati pri nizkem tlaku (104kPa); 2. Več kot ima spojina polarnih skupin, težje jo je ekstrahirati; 3. Večja kot je relativna molekulska masa spojine, težje jo je ekstrahirati. Modifikator CO2 je nepolarno topilo in na splošno se doda polarno topilo, da se izboljša njegova topnost v CO2, zato se imenuje modifikator. Pogosteje uporabljeni so metanol, aceton, etanol, etil acetat itd. Učinek modifikatorja je omejen. Medtem ko spreminja topnost superkritične tekočine, bo tudi oslabil učinek zajema ekstrakcijskega sistema, kar bo povzročilo povečanje koekstraktov, kar lahko moti analitično določitev. Količina uporabljenega modifikatorja mora biti majhna, na splošno ne sme presegati 5 %. Uporaba tehnologije ekstrakcije superkritične tekočine ima velike prednosti pri ekstrakciji naravnih snovi; lahko se uporablja v povezavi z GC, IR, MS, LC itd., da postane učinkovita analitična metoda.
